Laboratorija za istraživanje lipida 

1) ESTRAKCIJA UKUPNIH LIPIDA :

-          seruma

-          eritrocita

-          jetre

-          srca

    Ukupni lipidni ekstrakti pripremaju se estrakcijom smešom organskih rastvarača      hloroform-metanol metodom po Folch-u i modifikacijama njegove metode ( Harth, ..... )

2)  TLC HROMATOGRAFSKO RAZDVAJANJE LIPIDA

-          tankoslojna hromatogtafija (TLC) na sloju silika gela G u razvijaču n-heksan:dietil-etar:sirćetna kiselina (87:12:1, v/v/v ) za razdvajanje lipidnih klasa: fosfolipidi, diacilgliceroli, slobodne masne kiseline, holesterol, trigliceridi, holesterol-estri

-          TLC razdvajanje frakcija fosfolipida na silika gelu H uz  dodatak florisila :

a)         jednodimenzionalna hromatografija, kao razvijač koristi se bazni razvijač hloroform-metanol-20% amonijum hidroksid (65:30:5, v/v/v) 

b)         dvodimenzionalna hromatografija, za drugu dimenziju razvijač je hloroform-aceton-metanol-sirćetna kiselina-voda (70:17,5:12,5:10:4,4, v/v/v/v/v)

Iz ukupnog lipidnog ekstrakta TLC razdvajanjem možemo izolovati sledeće frakcije : lizolecitin, fosfatidilholin, sfingomijelini, fosfatidiletanolamin, difosfatidilglicerola, fosfatidilinozitola, fosfatidilserina, fosfatidinska kiselina.

3) METILACIJA MASNIH KISELINA

         Derivatizacija masnih kiselina u metil-estre utiče na kvalitet hromatografskog razdvajanja gasno-tečnom hromatografijom, jer su  njihovi metil-estri ispaljiviji od samih masnih kiselina. Masne kiseline se esterifikuju metanolom na 85˚C u prisustvu natrijum-hidroksida  u prvom i sumporne kiseline u drugom koraku .

4) HROMATOGRAFSKO RAZDVAJANJE METIL-ESTARA MASNIH KISELINA GASNO TEČNOM HROMATOGRAFIJOM

            (gasni hromatogram Varian 3400)

            Metil-estri masnih kiselina analiziraju se gasno-tečnom hromatografijom, (GLC, gas liquid chromatography). Koristi se semikapilarna kolona SP-2380 dimenzija 30m i 0.53 mm ID. Protok nosećeg gasa (azota) podešen je na 2.4-2.6 ml/min, uz korišćenje MAKE UP-a sa ukupnim protokom od 30 ml/min. Protok vazduha je 320 ml/min, a vodonika 30 ml/min. Temperatura detektora podešena na 250°C, a injektora na 220˚C. Temperaturni program za kolonu je sledeći : kolona se drži na 100˚C 15 minuta i temperatura podiže do 190˚C, brzinom 3˚C/minuti. Uzorak ranije pripremljenih metil-estara rastvoran je neposredno pre injektiranja u oko 10 µl heksana (zavisno od količine suvog ostatka), a od toga se injektuje  0.2 µl. Metil-estri masnih kiselina indentifikovani su upoređivanjem sa hromatogramom standarda metil-estara masnih kiselina. Rezultati su izraženi u procentima od ukupno razdvojenih masnih kiselina. GLC hromatogram masnih kiselina fosfolipida seruma prikazan je na slici 1.

                       
Slika 1: GLC hromatogram masnih kiselina

16:0 palmitiska kiselina

16:1n-7 palmitoleinska kiselina

18:0 stearinska kiselina

18:1 n-9 oleinska kiselina

18:2 n-6 linolna kiselina

20:3n-6 di-homo-gama-linolenska kiselina

20:4n-6 arahidonska kiselina

22:4n-6 dokozatetraenska kiselina

20:5n-3 eikozopentaenska kiselina

22:5n-3 dokozopentaenska kiselina

22:6n-3 dokozaheksaenska kiselina

5) SPEKTROFOTOMETRIJSKA ODREĐIVANJA U LIPIDNIM EKSTRAKTIMA I LIPIDNIM FRAKCIJAMA

-          ukupni lipidi

-          trigliceridi

-          holesterol

-          fosfolipidi

-        

NOVE METODE

1)         određivanje trans masnih kiselina u namirnicama

    Trans masne kiseline nisu prisutne u prirodi, ali nastaju u procesu proizvodnje i obrade namirnica. Zbog njihovog negativnog efekta , pre svega na rizik za nastanak kardiovaskularnih oboljenja,  unos ishranom je preporučeno da bude manje od 1g/dnevno. U Kanadi i USA usvojeno je da se na proizvodima obeležava  sadržajem trans masnih kiselina, a referentna metoda za analizu trans masnih kiselina je gasna hromatografija.  Uvođenje metode za  estrakciju ukupnih lipida u hrani,  identifikaciju i  kvantifikaciju trans masnih kiselina omogućilo bi nam da ostvarimo saradnju sa privredom, ali bi bilo koristno i za  razvoj naučno-istraživačkog rada.  Ispitivali bismo uticaja unosa trans masnih kislina na razvoj nekih patologija (kardiovaskularna oboljenja, insulinska rezistencija, bolesti jetre, kanceri... ) analizom sadržaja trans masnih kiselina u serumu i tkivima.

2)         nove metode za razdvajanje lipidnih klasa

Razdvajanjem lipidnih klasa SPE hromatografijom dobili bismo čiste frakcije triglicerida

 i holesterol-estara, čiji bi masnokiselinski sastav posle razdvajanja bilo moguće određivati gasno-tečnom hromatografijom. SPE razdvajanje je brza i jednostavna metoda, koja se u poslednje vreme sve više primenjuje. Postoje literaturni podaci za razdvajanja na aminopropilenskim kolonama i naši preliminarnim eksperimentima dobili smo zadovoljavajuća razdvajanja.